产品规格：

一、使用说明

1．准备工作

（1）提前30min将24孔细胞培养板放置于37℃细胞培养箱中预热。

（2）提前将取出在4℃冰箱中保存的人结直肠癌类器官培养基并平衡至室温。

（3）将15mL无菌离心管、50mL离心管、1.5mLEP管、移液器、移液管、无菌枪头、医用手术剪刀等表面消毒后放入超净工作台中紫外照射30min消毒。

（4）配制含10% FBS的DMEM备用。

2．肿瘤组织样本的原代提取

（1）将肿瘤组织样本放置于预冷的4℃组织保存液中直至开始处理。根据肿瘤组织样本的状态可在4 ℃组织保存液（YX-TP-01）中保存，最长保存时长约为48 h。

（2）将肿瘤组织样本放置于100 mm培养皿中，加入3mL试剂盒中的组织清洗液（YX-W-01）冲洗组织样本，吸弃上清液，重复该步骤2-3次。最后根据肿瘤组织样本尺寸，用适量组织清洗液浸润该组织。

（3）将培养皿放置于冰上，用手术剪刀耐心将组织样本切成1~3 mm³大小的组织碎片。

（4）将剪碎的组织转移至15mL离心管中，用5-10mL组织清洗液冲洗培养皿，将冲洗液一起收集在离心管中。1500 rpm，常温离心3 min，弃上清。

（5）根据组织样本体积，加入1-3mL本试剂盒中的组织消化液（YX-D-01）完全浸没组织样本，置于37 ℃恒温振荡培养箱中消化，摇床转速为200~300 rpm，消化30min~1h（根据样本的具体情况可调整消化时间）。

（6）加入3倍组织体积的10% FBS DMEM终止消化。用100μm滤网进行细胞过滤，1500rpm，离心3min后收集细胞。

l 如果过筛后的细胞沉淀呈红色，加入3-5倍体积的红细胞裂解液处理2-3min。完成裂解后加入10mL PBS重悬，1500rpm，离心3min。

（7）用10% FBS DMEM重悬细胞沉淀，对细胞悬液进行细胞计数。以24细胞孔板为例，按每孔1~2×10⁵个细胞密度计算需接种的孔数。1500rpm，离心3min得到细胞沉淀，将细胞沉淀置于冰上。

（8）将基质胶与人结直肠癌类器官培养基（YX-H-03）以1：1的比例混合，重悬细胞（24细胞孔板中每孔接种的总体积为60μL，每孔含基质胶30μL，该步骤需要全程在冰上操作）。

（9）将细胞沉淀与基质胶的混合悬液轻轻滴在已提前预热好的24孔板中央，使之形成圆顶状胶滴（每滴20μL，每孔3滴，每孔接种总体积为60μL）。缓慢将细胞培养板移至培养箱中37℃孵育30min，让基质胶凝固。

（10）基质胶完全凝固后，每孔缓慢加入500μL人结直肠癌类器官培养基，置于37 ℃，5% CO₂条件下静置培养。

3．结直肠癌类器官传代

（1）在显微镜下观察肿瘤类器官，待细胞聚集成类器官结构后观察2~3天，当类器官尺寸超过100μm或培养基变黄时进行传代。

（2）将含有类器官的24孔板转移到洁净工作台中，吸净细胞培养孔中的培养基，每孔加入500μL细胞解离液（YX-OD-01），并使用移液枪将载有细胞的基质胶胶滴吹散。

（3）将培养板置于37℃恒温培养摇床中，转速为200~300 rpm，消化30min。

（4）消化结束后将消化液收集到离心管中，加入2倍体积的PBS稀释终止消化。

（5）400 g离心3 min，弃上清。

（6）加入少量的人结直肠癌类器官培养基重悬细胞，进行细胞计数。一般以1：2的比例进行传代，或计数根据每孔细胞接种数量进行传代。按照“肿瘤组织样本的原代提取”的步骤（8）~（10）进行接种。

（7）每隔2~3 d观察类器官状态并更换培养基。

4．结直肠癌类器官冻存

（1）当类器官能够稳定传代4代后，可进行类器官的冻存（以24孔板培养为例）。

（2）在类器官传代稳定后，吸净细胞培养孔中的培养基，向每孔加入600μL细胞冻存液（YX-CC-01）重悬，使用移液枪将细胞轻柔吹散混匀。

（3）用移液枪将细胞悬液转移至冻存管中，将冻存管置于-80℃冰箱至少24 h，随后视储存需要转移至液氮中长期保存。

5．结直肠癌类器官复苏

（1）冻存的类器官从液氮或-80 ℃冰箱中取出后，立刻于37 ℃水浴下进行化冻。

（2）将解冻完成的类器官悬液加入到适量体积的PBS缓冲液中，400 g，离心3 min，弃去上清液。

（3）进行“结直肠癌类器官传代”操作，将冻存管细胞悬液接种至细胞孔板中。

产品说明书点击下载：http://pro098e88.pic8.websiteonline.cn/upload/ih0j.pdf