近年来，类器官因有助于更深入地了解人类生物学和疾病、增强诊断和治疗而备受关注。其具有与人体组织和器官生理上的高度相似性，满足了传统体内和体外模型中未满足的需求。基于成像的方法对于生物和临床应用中类器官的空间结构维持与细胞评估至关重要，但其复杂的结构需要采用传统的二维（2D）成像之外的更复杂的策略。目前，像激光共聚焦活细胞显微镜等方法已经被用于类器官的“4D”实时成像，而如光切成像等技术更是能够实现对类器官的高通量细胞成分筛选。尽管实时成像取得了明显的进步，但这些方法仍然无法进行多重成像，而这对于全面了解类器官的复杂表型是必要的。为了实现这点，现阶段主要依靠固定类器官以用于分析多个标记物的表达，但这也阻碍了对同一类器官随时间推移的纵向检测能力。
宾夕法尼亚大学的Jina Ko团队于近期发表了一篇关于对源自患者的活体脑类器官的多重成像的工作。该工作基于点击化学方法，能够实现对活体类器官的多路成像（N > 9），这种演化循环的成像方法能够同时捕获多个生物过程，有效观察每种细胞标记物的相对定位与丰度。相关论文“Live Organoid Cyclic Imaging”于2024年02月07日发表于《Advanced Science》上。
如图1所示，这种活体类器官循环成像的核心在于快速有效地猝灭不同波长的抗体偶联荧光染料，而不妨碍天然生化过程。已知四嗪/反式环辛烯（Tz/TCO）的点击化学反应具有卓越的超快动力学和生物正交特性，研究人员使用模块化的连接组件将荧光染料和抗体与嵌入的TCO分子连接起来（抗体-TCO-荧光基团，Ab-TCO-FL），以便和与猝灭剂黑洞猝灭剂3（BHQ3）缀合的Tz（BHQ3-Tz）进行点击化学反应，实现即时（秒级）高效（> 95%）的猝灭，避开耗时的裂解或漂白步骤，允许快速细胞分析。研究人员选择使用源自患者的胶质母细胞瘤类器官作为模型进行验证。
如图2所示，研究人员为了确定使用Ab-TCO-FL进行细胞内和细胞表面蛋白染色的最佳孵育和猝灭时间，将缀合物与类器官在不同的时间点进行孵育。对于细胞内蛋白的染色，研究人员将类器官固定并冷冻切片，与波形蛋白（VIM）靶向抗体进行共孵育，确认荧光达到饱和的时间。随后再加入BHQ3-Tz探针，可见荧光在1 min内就完全淬灭。而对于实时成像，研究人员使用液体界面系统对类器官进行成像，通过将类器官培养于Transwell上与表皮生长因子受体（EGFR）靶向抗体进行共孵育，观察荧光变化，并同样使用BHQ3-Tz探针进行猝灭，可见5 min内类器官的荧光信号由外围向中心逐渐消失。这些孵育与猝灭时间点可在后续的多重分析中作为参照。
基于上述结果，研究人员选择了9种特异性和非特异性胶质母细胞瘤生物标志物的组合，以对固定后的人类胶质母细胞瘤类器官进行多重评估，如图3所示。可以观察到基于生物正交点击化学技术，不同的特异性、非特异性标志物能够在同一类器官内进行染色与筛选，每一组免疫荧光染色不会受到前一个染色循环的影响，能够展示它们的相对表达以及共定位情况。
图3 患者来源胶质母细胞瘤类器官的固定后多重染色分析
研究人员进一步验证活体类器官中的多重分析方法，如图4所示。选择与固定组相同的表面蛋白对活体类器官进行免疫荧光染色，结果中各蛋白的相对表达以及共定位情况均与固定类器官结果一致。研究人员在进行循环染色的过程中对类器官进行了活/死染色，以验证类器官的活性是否受到染色-猝灭循环的影响，结果可见类器官的活性状况没有发生任何显著的变化，死细胞的数量以及细胞增殖情况均与未经历染色-猝灭循环的类器官没有显著性差异。在是否经历染色-猝灭循环的两组类器官之间筛选9种不同的管家基因组合进行qPCR分析，可见每个基因之间均没有显著差异。上述结果均证明活体类器官循环成像方法不会干扰细胞的活力与基因表达。
图4 活体患者来源胶质母细胞瘤类器官的多重染色和活力评估
这篇工作应用了循环成像方法，采用生物正交点击化学来染色并快速猝灭多个循环中的荧光信号，使得使用市售抗体对稀少的患者来源类器官中的多种蛋白质进行染色分析成为了可能，并实现对同一类器官不同蛋白间的相对表达与共定位情况的探究。
论文链接：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/advs.202309289
